A aplicação de RT-PCR em tempo real no Covid-19

O que é RT-PCR em tempo real?

A adição de genes fluorescentes ao sistema de reação de PCR, usando o acúmulo de sinal de fluorescência para monitorar todo o processo de PCR em tempo real e quantificando o modelo desconhecido por meio de uma curva padrão é chamada de tecnologia de PCR quantitativa por fluorescência em tempo real, também conhecida como Q em tempo real. -PCR.

O princípio da amplificação por PCR é o mesmo que o instrumento comum de PCR, exceto que os iniciadores adicionados durante a amplificação por PCR são marcados com isótopos, fluoresceína, etc., e os iniciadores e sondas fluorescentes são usados ​​para se ligar especificamente ao modelo para amplificação em o mesmo tempo.

Os resultados amplificados são coletados e transmitidos ao sistema de análise e processamento por computador através do sinal de coleta em tempo real do sistema de coleta de sinais de fluorescência para obter uma saída quantitativa dos resultados em tempo real.

A RT-PCR em tempo real é um dos métodos laboratoriais mais amplamente utilizados para detectar o vírus COVID-19. Embora muitos países tenham usado o RT-PCR em tempo real para diagnosticar outras doenças, como o vírus Ebola e o vírus Zika, muitos precisam de apoio para adaptar esse método ao vírus COVID-19, bem como para aumentar suas capacidades nacionais de teste.

Como o RT-PCR em tempo real funciona com o vírus COVID-19?

Uma amostra é coletada das partes do corpo em que o vírus COVID-19 se reúne, como o nariz ou a garganta de uma pessoa. A amostra é tratada com várias soluções químicas que removem substâncias como proteínas e gorduras e que extraem apenas o RNA presente na amostra. Esse RNA extraído é uma mistura do material genético da pessoa e, se presente, o RNA do vírus.

O RNA é transcrito reversamente para o DNA usando uma enzima específica. Os cientistas então adicionam fragmentos curtos adicionais de DNA que são complementares a partes específicas do DNA viral transcrito. Se o vírus estiver presente em uma amostra, esses fragmentos se ligam às seções alvo do DNA viral. Alguns dos fragmentos genéticos adicionados são usados ​​para construir filamentos de DNA durante a amplificação, enquanto outros são usados ​​para construir o DNA e adicionar marcadores aos filamentos, que são então usados ​​para detectar o vírus.

A mistura é então colocada em uma máquina de RT – PCR. A máquina percorre temperaturas que aquecem e resfriam a mistura para desencadear reações químicas específicas que criam cópias novas e idênticas das seções-alvo do DNA viral. O ciclo é repetido várias vezes para continuar copiando as seções alvo do DNA viral. Cada ciclo dobra o número anterior: duas cópias se tornam quatro, quatro cópias se tornam oito e assim por diante. Uma configuração padrão de RT-PCR em tempo real geralmente passa por 35 ciclos, o que significa que, ao final do processo, cerca de 35 bilhão de novas cópias das seções do DNA viral são criadas a partir de cada cadeia do vírus presente na amostra.

À medida que novas cópias das seções de DNA viral são construídas, os rótulos dos marcadores são anexados às fitas de DNA e, em seguida, liberam um corante fluorescente, medido pelo computador da máquina e apresentado em tempo real na tela. O computador rastreia a quantidade de fluorescência na amostra após cada ciclo. Quando um certo nível de fluorescência é ultrapassado, isso confirma que o vírus está presente. Os cientistas também monitoram quantos ciclos são necessários para atingir esse nível, a fim de estimar a gravidade da infecção: quanto menos ciclos, mais grave é a infecção viral.

Por que usar RT-PCR em tempo real?

A técnica de RT-PCR em tempo real é altamente sensível e específica e pode fornecer um diagnóstico confiável em menos de três horas, embora os laboratórios demorem em média entre seis e oito horas. Comparado a outros métodos de isolamento de vírus disponíveis, o RT-PCR em tempo real é significativamente mais rápido e tem um potencial menor de contaminação ou erros, pois todo o processo pode ser realizado em um tubo fechado. Continua a ser o método mais preciso disponível para a detecção do vírus COVID-19.

No entanto, a RT-PCR em tempo real não pode ser usada para detectar infecções passadas, o que é importante para entender o desenvolvimento e a disseminação do vírus, pois os vírus estão presentes apenas no corpo por uma janela específica de tempo. Outros métodos são necessários para detectar, rastrear e estudar infecções passadas, particularmente aquelas que podem ter se desenvolvido e se espalhado sem sintomas.