Perguntas freqüentes sobre células quebradas

1. E. coli expressa proteína estranha. Quando sonicado, é suspenso em PBS contendo 1% triton-X-100. O efeito do ultra-som é melhor. O efeito de 1% triton-X-100 ainda é óbvio. Algumas outras bactérias também funcionam, como o Streptomyces. Depois de expressar a proteína recombinante, as células foram rompidas por rompimento ultra-sônico de células, usando um banho de gelo, 400w, e esmagadas por 2s por 1s, mas uma grande quantidade de espuma foi gerada em pouco tempo, o que afetou o poder de esmagamento. Ambos os buffers pbs e tris eram assim. A fragmentação está incompleta e a proteína alvo está nessas células não quebradas, o que devo fazer?

Análise: A bolha será gerada porque a posição da sonda não está bem posicionada; a sonda deve estar perto do fundo, cerca de 0,5-1 cm; o poder vai variar de acordo com o instrumento, mas o nível do líquido pode ser observado, há flutuação mas não muito forte; você pode escolher células ultra-sônicas O britador é quebrado por 3s por 10s e quebrado por 20-30 vezes. A posição do chifre também deve ser anotada. Se o som estiver errado, deve ser ajustado a tempo; considerando a concentração de bactérias. Tente aumentar o volume ao esmagar, a força do Zui não deve exceder 60%; tente quebrar 8s por 8s, para algumas proteínas bacterianas, é difícil dissipar a proteína para causar desnaturação da proteína para produzir bolhas, que podem ser pausadas por um pouco mais de tempo. Uma proteína encontrada na forma de corpos de inclusão.

2. Quais são as condições para a sonicação de Streptomyces (actinomicetes)?

Analítico: os actinomicetos pertencem à porcentagem molar (G + C) (% molar) do grupo ramificado Gram-positivo (Eubacteria) na árvore filogenética do sistema procariótico, que possui as características moleculares e biológicas exclusivas dos procariontes. No entanto, em seus diferentes grupos, a composição química da parede celular varia muito. No ultrassom de E. coli, 400W é usado, e o método de quebra de 5s por 5s é efetivo, mas é usado em Streptomyces, e não tem efeito devido à diferença na composição da parede celular. O tratamento pré-fiação de Streptomyces (actinomicetos) é geralmente configurado para uma determinada concentração de suspensão bacteriana. As condições específicas para o esmagamento usando o disruptor de célula ultrassônica são: coletar as bactérias na solução de cultura de 24 h a 5.000 rpm por 5 min para coletar as células; lavando com um tampão Na2HPO-aH2PO pH 7,5 3 vezes, e depois As células foram formuladas numa suspensão bacteriana 1: 3 utilizando o tampão. Colocado em um tubo de ensaio de plástico grande de 40 mL; coloque o tubo grande de ensaio de plástico em um banho de gelo e esmague-o com um desregulador ultrassônico (potência de 200W, sonda de 1/2 ", esmagamento por 30s, 30s intermitente); solução de moagem a 12 000 r / min Centrifugue em alta velocidade por 30 min, recolher os restos celulares e sobrenadante.Lavar as células também pode ser lavado uma vez com solução salina pré-resfriado ou Tris-HCl em pH 8. Além disso, a dose ultra-sônica varia muito com a quantidade de amostra e bactérias.A potência pode ser de 400- 600w, triturado por 5s, parado por 5s, banho de gelo, e a concentração final de 1 mM de PMSF é adicionada.A fim de determinar a intensidade e freqüência ultra-sônica apropriada, é necessário verificar se as bactérias estão completamente quebradas a qualquer momento.